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1. 弁言

妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus, GDM）是指在妊娠时刻初度发生的糖耐量受损，与妊娠期高血压、早产等多种妊娠不良结局关连。GDM看成妊娠期最为常见的代谢性疾病，评释其发病机制风趣重要。胰岛素抵触是GDM的基本病理生理编削，在GDM发病程度中起到了迫切作用。而看成发生胰岛素抵触的主要形势之一，脂肪组织发生功能十分是GDM的关键性早期事件。

在病理现象下，脂肪组织巨噬细胞（Adipose tissue macrophages, ATMs）向促炎表型分化比例加多，使脂肪组织形成慢性低度炎症环境，是脂肪组织发生胰岛素抵触的迫切原因。ATMs里面的线粒体含量编削会导致细胞发生代谢重塑并产生能量代谢的变化，这与ATMs的表型鼎新及功能密切关连。纯正纳米管（Tunneling Nanotubes, TNTs）是一种通顺两个细胞的通说念式膜结构，不错完了细胞间线粒体的快速转运，主要形成于间充质干细胞、免疫细胞及肿瘤细胞。而脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cell, ADSCs）与ATMs是脂肪组织中占主导地位的间充质干细胞和免疫细胞。

为了探究ADSCs和ATMs流程TNTs的线粒体转运模式，以及该转运模式对ATMs代谢模式和表型鼎新的影响，并探索关连调控的分子机制，运用棕榈酸（钠）模拟高脂环境刺激脂肪组织巨噬细胞（ATMs）与脂肪源性干细胞（ADSCs），以揭示ADSCs与ATMs互作致脂肪组织炎症的新机制。

2.实践材料

本文给与棕榈酸钠高脂细胞添加剂（KC002，Xi'an Kunchuang Technology, China）看成游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），完成体外细胞实践。给与可靠的高脂细胞添加剂，大致保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精确，况且无需屡次加热助溶，显耀减少了操作门径，晋升了实践的褂讪性。骨子使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到有余培养基中即可。

3. 实践步骤

1）小鼠原代脂肪源性干细胞的索要

（1）登科10-12周平素C57BL/6J雌性小鼠，脱颈法正法。将正法后小鼠固定于剖解台上，用75%乙醇充分消毒。（2）用无菌组织剪和无菌镊子掀开小鼠腹腔，取出大网膜脂肪组织，用含1%青霉素-链霉素溶液的PBS清洗2-3次。（3）索要SVF。（4）将SVF用DMEM/F12有余培养基重悬，铺板于6cm细胞培养皿中，于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养，依期换液，待细胞和会度达到90%傍边进行传代，传代2-3次后即可得到原代脂肪源性干细胞（ADSCs）（5）通过流式细胞仪果决ADSCs，CD14-CD45-CD90+CD44+的细胞被觉得是ADSCs。

2）小鼠原代脂肪组织巨噬细胞的索要

（1）索要小鼠大网膜脂肪组织SVF。随后通过磁珠分选（MACS）索要小鼠原代脂肪组织巨噬细胞（ATMs）。（2）将MACSBSA储存液和autoMACS冲洗液按1:20比例夹杂设立成MACS缓冲液。（3）用80μl MACS缓冲液重悬SVF，加入20μl抗F4/80微珠，混匀，4℃避光孵育15min。（4）用1ml MACS缓冲液洗涤细胞，300g离心10min，弃上清。500μl MACS缓冲液重悬。（5）将MACS分选架、LS分选柱、分选器进行拼装，向分选柱中加入3mlMACS缓冲液润洗，恭候缓冲液行将流空时，极少屡次加入孵育后的细胞样本，在分选柱下方舍弃15ml离心管，荟萃F4/80阴性细胞。（6）待缓冲液行将流空时，向分选柱中加入3mlMACS缓冲液，肖似3次，荟萃一齐F4/80阴性细胞。（7）待分选柱中液体绝对流完，将分选柱放入5ml无菌离心管，加3mlMACS缓冲液于分选柱中，安设活塞并马上鼓动，从而荟萃F4/80阳性细胞，即为ATMs。（8）将荟萃到的ATMs置于6cm细胞培养皿中，用RPMI1640有余培养基于37℃5% CO2细胞培养箱中培养，用于后续实践。

3）不同高脂高糖要求下细胞间线粒体转运效果检测

（1）将合适密度的小鼠原代ADSCs和ATMs细胞共培养，将ADSCs铺板于12孔细胞培养板，将ATMs铺板于Transwell小室，随后将Transwell小室置于12孔板顶部，从而完了ADSCs和ATMs的分隔培养。

（2）凭证组别不同，辞别向共培养细胞中加入棕榈酸钠（终浓度0.3mmol/L）、D-葡萄糖（终浓度22.5mmol/L）、D-甘霖醇（终浓度22.5mmol/L）。

（3）凭证加入试剂以及培养模式的不同，分为以下10个组别：

CellTrace™Violet象征ADSCs+MitoTracker™RedCMXRos象征ATMs：①对照组，②高脂组（加棕榈酸钠），③高糖组（加D-葡萄糖），④高糖对照组（加D-甘霖醇），⑤Transwell小室隔断培养组；

MitoTracker™RedCMXRos象征ADSCs+CellTrace™Violet象征ATMs：①对照组，②高脂组（加棕榈酸钠），③高糖组（加D-葡萄糖），④高糖对照组（加D-甘霖醇），⑤Transwell小室隔断培养组。

（4）系数组别均在37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养16h。消化并荟萃细胞，立即进行流式细胞仪上机检测。

4）巨噬细胞表型检测及炎症因子水平测定

（1）将索要的原代ATMs及ADSCs铺板于12孔细胞培养板中。凭证培养方式不同，将细胞分为4组，系数组别均培养16h：

①单独培养组（Monoculture）：ATMs单独培养；

②高脂组（Monoculture+PA）：在ATMs单独培养的基础上，添加0.3mmol/L的棕榈酸钠。

③共培养+棕榈酸钠组（Coculture+PA）：ATMs与ADSCs共同培养并添加0.3mmol/L的棕榈酸钠；

④Transwell小室隔断培养+棕榈酸钠组（Transwellculture+PA）：将ATMs和ADSCs辞别培养于Transwell小室的上基层并添加0.3mmol/L的棕榈酸钠；

（2）荟萃各组细胞并进行流式染色。给与MACS步骤分离共培养细胞。给与PEanti-mouseCD86抗体、FITCanti-mouseCD206抗体、APCanti-mouseF4/80抗体对ATMs进行染色，F4/80+细胞被果决为巨噬细胞，其中CD86+CD206-细胞被果决为促炎表型，CD86-CD206+被果决为抑炎表型

（3）荟萃各组培养基进行炎症因子水平测定。

4.实践限制分析

1）高脂及高糖现象驾驭线粒体转运

高血脂和血糖水平是GDM患者常见的两大特征，为了探究高脂和高糖现象是否会对ADSCs和ATMs间的线粒体转运产生影响，在ADSCs和ATMs共培养系统中添加过量的棕榈酸钠（PA）或葡萄糖以模拟高脂或高糖现象，并用添加了甘霖醇的等渗培养基看成对照，每组实践肖似3次。按照与前述商酌的细胞象征步骤，通过流式细胞术检测，发现高脂和高糖现象均不同程度驾驭了ADSCs和ATMs之间的线粒体转运，高脂组的驾驭作用尤甚（图1）。

此外，将ADSCs和ATMs辞别培养在Transwell小室的表层和基层中，以阻断两种细胞间TNTs的形成，同期不影响细胞间其他容颜的分子传递。限制发现与旧例共培养组比较，Transwell组中ADSCs和ATMs之间的线粒体转运比例大大裁减（图1），这确认TNTs结构是ADSCs与ATMs间线粒体转运的主要路线。

图1 不同要求下ATMs与ADSCs之间的线粒体转运效果

2）线粒体转运受阻变成ATMs更易向促炎表型分化及炎症因子水平升高

能量代谢现象的编削很可能会影响巨噬细胞的表型以及功能。为了探究线粒体转运对ATMs表型的影响，咱们通过添加棕榈酸钠（PA）以联结ATMs向促炎表型分化，并检测促炎ATMs（CD86+CD206-）比例。凭证不同培养要求以及是否添加PA，将ATMs分为单独培养组（对照组）、单独培养+PA组、共培养+PA组以及Transwell培养+PA组，每组实践肖似3次。通过流式细胞术，咱们发现与单独培养组比较，单独培养+PA组中促炎ATMs（CD86+CD206-）比例出现了昭着升高；而相较于单独培养+PA组而言，共培养+PA组中促炎ATMs比例显耀裁减（图2），即共培养的方式显耀驾驭了PA所导致的ATMs促炎表型分化。Transwell培养+PA组的促炎ATMs比例显耀高于共培养+PA组（图2）。此外，各组细胞培养基中的炎症因子水平也与促炎细胞比例趋势商酌（图2）。以上限制确认线粒体的转运不错驾驭ATMs的促炎分化倾向，通过Transwell使流程TNTs的线粒体转运受阻会加重ATMs向促炎表型分化以及炎症因子的产生。

图2 不同培养要求下ATMs表型比例及炎症因子水平。a)不同培养要求下促炎ATMs（CD86+CD206-）与抑炎ATMs（CD86-CD206+）ATMs比例。b)不同培养要求下培养基中炎症因子浓度。

小编有话说：

本文给与300μM棕榈酸钠、16h刺激脂肪组织巨噬细胞（ATMs）与脂肪源性干细胞（ADSCs）模拟臃肿患者体内高糖高脂环境，体外细胞实践标明棕榈酸（钠）形成的高脂环境驾驭了ATMs与ADSCs之间的线粒体转运，流程TNTs取得线粒体后，ATMs的基础呼吸速度、最呐喊吸速度以及ATP产收效果升高；流程TNTs的线粒体转运受阻导致了棕榈酸钠刺激下的ATMs促炎表型比例加多、炎症因子水平升高、线粒体膜电位下落以及归并才气减轻。

上述实践要求和限制，可能会因加药时的细胞密度、代数、现象或耐药性的不同而有所区别。因此，残忍具体实践中，先通过浓度、时间梯度实践，寻找出适应于所用细胞的最好药物作用浓度和最好作用时间，一般残忍在200-500 umol/L限制内、作用24-48小时。

参考文件

陈炳南. 在妊娠期糖尿病中巨噬细胞与脂肪源性干细胞通过隧 说念纳米管转运线粒体的机制征询[D]体育游戏app平台,博士论文,2024(5).